Problemy z utrzymaniem żywotności komórek w systemie obrazowania żywych komórek podczas obrazowania

Obrazowanie żywych komórek jest ważnym narzędziem analitycznym w laboratoriach badających biomedyczne dyscypliny badawcze, takie jak biologia komórki, neurobiologia, farmakologia i biologia rozwoju. Obrazowanie utrwalonych komórek i tkanek (w przypadku których fotowybielanie jest głównym problemem) zwykle wymaga wysokiej intensywności oświetlenia i długiego czasu ekspozycji; należy ich jednak unikać podczas obrazowania żywych komórek. Mikroskopia żywych komórek zwykle wiąże się z kompromisem między uzyskaniem jakości obrazu a utrzymaniem zdrowych komórek. Dlatego też, aby uniknąć wysokiej intensywności oświetlenia i długiego czasu ekspozycji, rozdzielczość przestrzenna i czasowa są często ograniczone w eksperymencie. Obrazowanie żywych komórek obejmuje szeroki zakres metod obrazowania ze wzmocnieniem kontrastu do mikroskopii optycznej. Większość badań wykorzystuje jeden z wielu typów mikroskopii fluorescencyjnej, która często jest łączona z technikami światła przechodzącego, które zostaną omówione poniżej. Ciągły postęp w technikach obrazowania i projektowaniu sond fluorescencyjnych zwiększa moc tego podejścia, zapewniając, że obrazowanie żywych komórek będzie nadal ważnym narzędziem w biologii.

Ważną przestrogą jest zapewnienie, że komórki są w dobrym stanie i działają normalnie na etapie mikroskopu z oświetleniem w obecności syntetycznych fluoroforów lub białek fluorescencyjnych. Warunki, w których komórki są utrzymywane na etapie mikroskopu, chociaż bardzo zmienne, często decydują o sukcesie lub porażce eksperymentu.

Dostępne są różne media do hodowli komórkowej w zależności od konkretnych wymagań biochemicznych komórek. Media do hodowli zawierają różne składniki, w tym aminokwasy, witaminy, sole nieorganiczne (minerały), pierwiastki śladowe, składniki kwasów nukleinowych (zasady i nukleozydy), cukry, pośrednie produkty cyklu kwasów trikarboksylowych, lipidy i koenzymy. W mediach do hodowli tkankowej ważnym krokiem jest kontrola stężenia tlenu, pH, pojemności buforowej, osmolarności, lepkości i napięcia powierzchniowego. Dostępne w handlu formulacje mediów często zawierają barwnik wskaźnikowy (np. czerwień fenolową) w celu wizualnego określenia przybliżonej wartości pH. System buforowy dwutlenku węgla i wodorowęglanu do regulacji pH jest potrzebny dla prawie wszystkich linii komórkowych. Komórki muszą być hodowane w atmosferze zawierającej niewielką ilość dwutlenku węgla (zwykle 5–7%) w inkubatorach w celu kontrolowania stężenia rozpuszczonego gazu. W przypadku obrazowania żywych komórek zapewnienie odpowiedniej atmosfery z dwutlenkiem węgla może być trudne, a to zwykle wymaga specjalnie zaprojektowanych komór hodowlanych do regulowanej atmosfery. Wymagania tlenowe mogą się różnić w zależności od linii komórkowych, ale normalne poziomy napięcia tlenu atmosferycznego są odpowiednie dla większości kultur. Jeśli chodzi o osmolarność, większość linii komórkowych ma dużą tolerancję na ciśnienie osmotyczne, z dobrym wzrostem przy osmolarnościach między 260 a 320 miliosmolarnych. Gdy komórki są hodowane w kulturach na otwartych płytkach lub szalkach Petriego, można użyć podłoża hipotonicznego, aby poradzić sobie z parowaniem.